NATURE COMMUNICATIONS：呼吸与自发运动和皮层准备电位有耦合关系

       自发运动是自我意识的一个基本要素。准备电位（readiness potential--RP，自发动作前的一种缓慢神经活动）反映准备自发运动的神经过程；但至今对RP的解释仍有争议。先前研究表明内部身体信号影响感觉加工和持续神经活动，瑞士联邦理工学院认知神经科学实验室Hyeong-Dong Park和Olaf Blanke等人在Nature Communications杂志发表文章，研究内感受器身体信号在自发运动和RP中的潜在作用。实验要求被试执行两个经典的自发运动任务（Kornhuber任务和Libet任务）以及一个外部触发动作任务，同时记录被试的EEG和ECG信号以及呼吸数据。研究集中分析自发运动与心跳相位（心缩相位vs.心舒相位）、呼吸相位（吸气相位vs.呼气相位）的耦合。

结果发现：

1）被试在呼气过程中更频繁地进行自发运动。       

2）在外部触发动作过程中不存在这种呼吸-动作耦合。

3）RP波幅受到呼吸的调节。研究说明呼吸波动（而非心跳波动）与自发运动、自发运动的神经指标（RP）耦合，并且在外部触发动作过程中不存在这种呼吸-动作耦合。研究者的发现说明自发运动与呼吸系统耦合，进一步表明RP（准备电位）与持续神经活动波动（由非自主和循环运动呼吸驱动）有关。 

方法：

被试：实验1有20名被试；实验2和实验3有34名被试。

程序：实验1（Kornhuber任务）：要求被试每8-12s用右手食指主动按键。要求被试不要数数字评估时间，避免使用规则或有节奏按键，最大限度发挥任务的自发性。实验1结束后，采集被试闭眼静息态数据3min。

实验2（Libet任务）：一个红点以每周期2560ms的速度在钟面旋转。要求被试至少等待一个完整的旋转后，用右手食指按键。要求被试避免预先假设点的位置，避免使用相同的试次间间隔。被试按键结束后，点自动消失。4s后，红点再次出现在相同的位置，要求被试判断自己首次感觉到按键意识的钟表位置（W-time）。

实验3（外部触发任务）：要求被试在觉察到绿点后按键，该绿点在红点旋转时出现（出现时间为200ms）。按键后红点消失。根据被试在Libet实验中的表现设定绿点出现的间隔。为了收集实验3中绿点出现的个体间隔数据，实验开始是Libet任务，剩余5个block伪随机。被试完成实验2和实验3后，采集5min EEG睁眼静息态数据。 

呼吸记录和分析：使用呼吸带（采样率为2000Hz）采集连续呼吸信号，使用FieldTrip软件分析数据。为确定按键时的瞬时呼吸相位，首先进行0.2-0.8Hz的带通滤波，并且进行Hilbert变换（Fig. S1）。通过将呼吸信号与在基于个体定义的模板关联来检测吸气峰值。对于MI（Modulation index 调制指数）分析，连续呼吸数据降采样到512Hz。

Fig. S1 呼吸相位计算。呼吸信号进行0.2-0.8Hz的带通滤波。然后使用Hilbert转换获得呼吸相位。

EEG采集和分析：使用64导主动电极EEG系统收集EEG信号（ActiveTwo system, Biosemi），采样率为2048Hz，并进行400Hz的在线低通滤波。
   1）EEG数据降采样为512Hz，并进行0.1-40Hz的带通滤波；

2）然后对数据进行全脑平均参考；

3）零点设置为按键开始时，进行分段：-4至1s；

4）伪迹检测：大于±3SD的时间段删除；

5）平均试次。经典的RPs出现在额中部电极点，因此，研究者采用Cz, FCz, Fz, AFz。

    ECG记录和分析：记录EEG的同时记录ECG信号（同样采用BIOSEMI产品），并对数据进行相同的预处理。双极ECG电极放在右肩和腹部左侧底部。为计算按键时的ECG信号，研究者采用基于峰值觉察算法的方法。通过将ECG信号与基于个体定义的模板QRS复合体。使用公式：φ(t) = 2π((t –ta)/(tb − ta))计算ECG的相位，ta和tb是围绕当前时间样本的两个连续峰值的时间（Fig. S3）。

Fig. S3 心跳相位的计算。采用基于峰值觉察算法的方法计算心率相位。

呼吸-自发运动耦合的统计：使用置换检验探索按键时间和呼吸相位之间相关的显著性。1）使用Hodges–Ajne检验评估循环数据的一致性。Hodges–Ajne检验结果是得到统计量（M，定义为在圆圈的一半中可以观察到的最小数据点数）。当检验统计量小于预期数时，拒绝零假设。2）将原始统计量M与随机置换生成的数据M值进行比较。置换次数为1000次。 

RP波幅和呼吸相位之间的MI（调制指数）：评估呼吸相位和RP波幅之间的耦合：

1）计算单个试次-4至0s时间窗（大约一次呼吸周期）的呼吸相位和RP波幅。

2）根据跨越0-2π区间的六个呼吸相位对数据进行平均。六个呼吸相位没有六个平均RP（准备电位）波幅的试次被排除。对每个呼吸相位的RP波幅进行归一化处理（Fig. 3）。

3）通过计算MI量化RP振幅与呼吸相位之间的耦合程度，该方法使用平均RP波幅量化了相位的波幅分布偏离均匀分布的程度。越强的相位-波幅耦合（越大的偏离）导致越高的MI值。

4）使用置换检验测量MI的显著性。首先使用原始的EEG-呼吸数据计算总平均MI。接下来，将原始总平均MI与随机生成数据的MI值进行比较，置换次数为1000次。

5）为计算呼吸相位与静息态EEG波幅之间的MI值，EEG数据以吸气峰值为零点，分为-2至2s的时间窗（Fig. 4a）。然后采用相同的方法分析静息状态EEG波幅与呼吸相位之间的耦合。 

结果：

呼吸相位与自发运动相耦合：

1）实验1的结果发现按键（等待时间）之间的间隔分布显示右倾斜形状（Fig. 1a）。按键间隔平均为11.20±2.3s，这些间隔的标准差平均为3.26±1.70s，该结果表示被试成功执行了Kornhuber任务。

2）自发运动的开始是否与自发的呼吸信号相关。计算按键开始时的呼吸相位（Fig. 1）。结果发现：在开始吸气之前的呼气阶段，尤其是呼气的最后阶段，被试更频繁地按键。20名被试中有19名在呼气阶段观察到按键时的平均呼吸相位，即在0到π之间（Fig. 1b）。

3）实验结束后，要求被试回答他们是否意识到呼吸或心率与按键的关系（Q1），以及被试是否根据呼吸或心率去按键（Q2）。20名被试中有18名被试回答NO，这说明被试未意识到自发运动和呼吸之间的关系。

Fig. 1 在Kornhuber任务中，自发运动和呼吸相位之间的耦合。

a. 等待时间的分布（n=20）显示出典型的右偏形状。

b. 自发运动开始时，呼吸相位的分布情况。空的黑圈代表每个被试在按键时的平均呼吸相位。被试在呼气相位更频繁地发起自发运动。直方图显示32名被试的所有按键的分布，这也集中在呼气相位。红点表示总平均呼吸相位。

c. 置换检验结果直方图。结果显示按键时间与呼吸相位相耦合。蓝线表示原始数据的p值。

4）实验2中，按键等待时间平均为6.67±1.52s，等待时间的标准差平均为2.20±0.97s。W-time平均为-0.26±0.17s。实验2重复实验1的结果，即被试在呼气阶段更频繁地按键（Fig. 2b, c）。32名被试中有30人在呼气阶段观察到按键时的平均呼吸相位（Fig. 2b）。实验后要求被试回答他们是否意识到呼吸或心率与按键的关系（Q1），以及被试是否根据呼吸或心率去按键（Q2）。32名被试中有31名被试回答NO。

a. 等待时间的分布（n=32）显示出典型的右偏形状。

b. 自发运动开始时，呼吸相位的分布情况。空的黑圈代表每个被试在按键时的平均呼吸相位。被试在呼气相位更频繁地发起自发运动。直方图显示32名被试的所有按键的分布，这也集中在呼气相位。红点表示总平均呼吸相位。

c. 置换检验结果直方图。结果显示按键时间与呼吸相位相耦合。蓝线表示原始数据的p值。

呼吸相位与非自发运动没有耦合关系：

在外部触发动作任务中（实验3），从钟表旋转开始到按键之间的时间间隔平均为7.03±1.56s（Fig. S2），间隔的标准差平均为1.98±0.85s。置换检验说明在外部触发动作任务中，被试的按键与呼吸相位无耦合关系（Fig. S2b, c）。这些结果说明呼吸相位和运动开始之间的耦合关系是特异于自发运动的，而没有在外部触发动作任务中发现。

Fig. S2 实验3中，外部触发按键开始和呼吸相位。

a. 从试次开始到外部触发按键的间隔分布（n=32）。

b. 外部触发按键开始时，呼吸相位的分布情况。空的黑圈代表每个被试在按键时的平均呼吸相位。被试在呼气相位更频繁地发起自发运动。直方图显示32名被试的所有按键的分布，均匀分布。红点表示总平均呼吸相位。

c. 置换检验结果直方图。结果显示实验3中的按键时间与呼吸相位没有耦合关系。蓝线表示原始数据的p值。

心跳相位与自发运动没有联系：

检验心跳信号的相位是否与自发运动有联系。采用基于峰值觉察算法的方法计算ECG信号相位（Fig. S3）。在实验1中，按键时的心跳相位分布是不均匀的（Fig. S4）。在实验2和3中，心跳相位和按键之间的相关不显著（Fig. S5a, S5b）。这个结果说明被试按键与心跳相位没有关系。总的来说，研究者的行为结果显示在两种经典的自发运动任务中，自主呼吸相位，而不是心跳相位，与自发运动开始有耦合关系。并且在外部触发运动中缺乏这种呼吸-运动耦合。问卷数据进一步表明，被试没有意识到呼吸与其自发运动之间的这种耦合关系。

Fig. S4 实验1中，自发运动时的心率相位分布。空的黑圈代表每个被试在按键时的平均心跳相位。未出现偏好相位。直方图显示20名被试的所有按键的分布，均匀分布。

Fig. S5 实验2和3中，按键时的心率相位分布。空的黑圈代表每个被试在按键时的平均心跳相位。未出现偏好相位。直方图显示31名被试的所有按键的分布，均匀分布。

呼吸相位和RP波幅之间的耦合：

检验呼吸信号是否影响RP（准备电位）。由于1）实验1和2中的范式在RP研究中经常使用；2）在两种任务中，研究者观察到相似的呼吸-运动耦合；3）增加统计检验力，因此研究者结合实验1和实验2的EEG-呼吸数据。首先，通过平均自发运动之前的EEG信号来识别典型的RPs成分（Fig. 3a），自发运动开始前大约2s在中部和额中部出现RPs。接下来检验RP波幅是否与呼吸信号的相位有联系。简单来说，根据呼吸阶段六个bins，计算单个试次的平均RP波幅。为确定呼吸相位和RP波幅之间耦合的统计显著性，计算每个被试的调制指数（MI）。结果说明，相比于吸气阶段，被试在呼气阶段的RP波幅更小（Fig. 3b）。置换检验结果说明原始分数的MI值显著大于随机信号的MI值，这证明了呼吸和RP之间的这种显著的相位-波幅耦合（Fig. 3c）。

Fig. 3 呼吸相位与准备电位（RP）波幅之间的耦合。

a. RP EEG波幅（额中部电极点）。-4至-2s以及-2至0s的地形图。

b. RP波幅作为呼吸相位的六个相同大小bins的函数。

c. MI值检验结果直方图。蓝线表示原始数据的MI值的p值。结果说明原始数据MI值显著大于随机数据生成的MI值。

静息态EEG不受呼吸相位的调节：

为排除RP波幅与呼吸相位之间的这种耦合关系可能仅仅反映了呼吸对EEG信号的噪音影响，研究者检验呼吸相位是否与静息态EEG波幅的调节有关：1）计算锁时到吸气峰值的静息态EEG波幅（与RP波幅相同的电极点）。2）计算静息态EEG波幅和呼吸相位之间的MI值（Fig. 4a, b）。置换检验结果显示原始信号的MI值与随机信号的MI值无显著差异（Fig. 4c）。这个结果说明锁时到吸气峰值的静息态EEG波幅不依赖于呼吸相位，呼吸信号和RP波幅之间的耦合关系与呼吸信号对静息态EEG活动的噪音影响无关。

Fig. 4 呼吸相位和静息态EEG波幅。

a. 锁时到吸气峰值的静息态EEG波幅（额中部电极点，n=50）。

b. 静息态EEG波幅作为呼吸相位的六个相同大小bins的函数。

c. MI值检验结果直方图。蓝线表示原始数据的MI值的p值。结果说明锁时到吸气峰值处的EEG波幅不依赖于呼吸相位。

总结：

该研究的主要发现：

1）被试的呼吸模式与自发运动有耦合关系。该结果在两种常用的自发运动范式以及两个不同的被试群体中均可观察到：Kornhuber任务（Experiment 1）和Libet任务（Experiment 2）。这说明呼吸相位与间隔估计无关。

2）呼吸相位与非自发运动无耦合关系（实验3，外部触发动作）。

总体来说，3个实验的发现证明呼吸相位（内感受器加工）与自发运动有关，而非间隔估计或外部触发运动。总的来说，自主呼吸影响人类自我意识和运动认知的一个基本方面（自发运动）以及最经典的EEG成分之一，RP（准备电位）。该研究发现通过结合神经科学的两个不同领域，为RP提供了新的见解：1）RP与持续的神经元活动波动有关；2）内感受器加工，特别是与呼吸有关的加工，是这种持续神经元波动的重要来源。弥合这两个独立领域之间的差距，研究者表明自发运动中的RP与呼吸系统驱动的持续神经元活动的波动有关。最后研究者的结果也有可能有助于解决Benjamin Libet提出的RP与相关神经活动（主观感觉或运动意图）之间的困惑问题。研究者建议RP不对应于“自发运动的无意识大脑启动”，而至少部分反映了呼吸相关的皮层加工，这与自发运动是耦合关系。

原文：Breathing is coupled with voluntary action and the cortical readiness potential

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