溶酶体神经轻链基因表达的皮质网络与口吃皮质网络相交

持续性发展性口吃是一种言语障碍，其特征是言语表达流利性受到干扰，这种障碍在儿童早期(集中于2-4岁)出现。口吃的发病率和患病率因年龄组而异，但是从所有年龄阶段的发病率看，以往研究认为在5%左右，但最近的调查给出了更高的数字，从5%到18%。在最近的文献中，通过流行病学调查和综述分析，患病率大约1%。口吃的主要症状包括正常流畅性话语的中断和说话的断断续续模式。重复出现下列情况：声音和音节重复、声音延长、感叹词、断句、沉默停顿、绕口令、伴随身体紧张的言语和/或单音节整词重复。口吃给发展性口吃者带来了许多生活困难，并且严重影响了他们的生活质量和受教育机会。因此，对口吃的研究从很早就已经开始。

但即使至今，其神经生物学基础尚不清楚，这其中最主要的原因是口吃的成因可能涉及许多方面。虽然这一领域的最新发展已经使研究人员能够确定几种与口吃有关的基因图谱，但这些特定的遗传背景是如何影响神经回路的，以及它们是如何产生或促进口吃语言的出现的，这些都是未知的。

为此，来自麻省总医院和哈佛医学院的研究者进行了一项堪称“大海捞针”式的研究。在这项研究中，作者使用功能连接方法和图论确定了具有口吃特征的大规模皮层网络。通过一项空间相似性分析，检查了口吃皮质网络的拓扑结构是否与先前报道的来自Allen人脑图谱蛋白质编码转录组数据的口吃基因的遗传表达水平相交叉。

研究结果发现，参与甘露醇-6-磷酸溶酶体靶向途径的GNPTG基因与口吃皮质网络显著共定位。富集（enrichment analysis）分析表明，与口吃皮层网络相关的基因在神经丝细胞骨架组织中具有明显的过度表达的生物学功能。通过比较GNPTG和本研究涉及的神经丝基因之间的遗传相互作用，研究了溶酶体代谢途径、细胞骨架组织和口吃之间的关系。结果发现，包括CDK5、SNCA和ACTB在内的内酯酶体网络基因在溶酶体和神经轻链基因之间起着功能连接的作用。该研究发表在Progress in Neurobiology杂志。

这些发现支持了口吃是由溶酶体功能障碍引起的观点，溶酶体功能障碍对语言神经元回路的神经丝组织有有害影响。它们有助于阐明溶酶体突变和口吃之间有趣的、尚未解决的联系。 

基本知识提前了解：

神经轻链蛋白(Neurofilaments,NF)：构成神经元轴突中间纤维的特异性分子蛋白,是神经元细胞骨架的重要成分,主要定位在成熟神经元的胞体和突起中,负责轴浆运输,维持神经元正常形态及保持神经纤维的弹性,防止断裂,典型的神经丝纤维长10nm,可增加轴突的直径,提高轴突的脉冲传导速度,其在轴突中呈平行排列,在胞体中则是随机的,在轴突的运输过程中神经丝蛋白会发生磷酸化与去磷酸化,以此进行自我更新,表明磷酸化对神经丝的生理功能有重要影响。

细胞骨架（英语：Cytoskeleton）：一般是指细胞内细胞质中的由蛋白质构成的纤维的网络结构。它是一个动态结构，其中有一部分是不断的被破坏，更新或新建的。

在生命的所有生物领域（古菌，细菌，真核生物）的细胞里都有细胞骨架被发现（特别是在所有真核细胞，包括人类，动物和植物细胞，甚至于噬菌体中都有细胞骨架被发现）。不同生物体的细胞骨架系统是由相似的蛋白质组成。但是，细胞骨架的结构，功能和动态行为可以是非常不同的，这取决于生物体和细胞类型。类似地，在同一细胞类型内细胞骨架的结构，动态行为和功能可以通过与其他蛋白质和网络的以前的历史关联发生变化。

溶酶体（lysosome）：为细胞浆内由单层脂蛋白膜包绕的内含一系列酸性水解酶的小体。溶酶体是细胞内具有单层膜囊状结构的细胞器，溶酶体内含有许多种水解酶类，能够分解很多种物质，溶酶体被比喻为细胞内的“酶仓库”“消化系统”。

常染色体遗传纯和（autosomalrecessive disorder）：致病基因在常染色体上，基因性状是隐性的，即只有纯合子时才显示病状。此种遗传病父母双方均为致病基因携带者，故多见于近亲婚配者的子女。  

研究背景：    

关于口吃的病因有各种各样的理论和治疗假设。最初，临床医生寻找焦虑和口吃之间的关系。因此,一些研究人员深入探讨了口吃作为精神疾病原因的可能性。随着神经影像学技术的出现，神经解剖学因素和大脑连接的发现引起了研究范式的转变，例如，大量研究发现，口吃与许多区域的灰质变化有关，包括：辅助运动区(SMA)、初级运动区、额下回、岛盖部(Brodmann区[BA] 44)、经典的布洛卡和韦尼克区、颞上回、中央下区(BA43)、岛叶、楔前叶、基底神经节-丘脑-皮层环、小脑等。最近的研究还发现口吃与与默认网络的功能异常以及与支配额叶和顶叶运动区域、听觉和边缘脑区的轴突束的变化有关。

除此以外，关于口吃的成因的基因方面的研究也大量出现。已有许多研究发现，语言发育与FOXP2、ROBO1、CNTNAP2、KIAA0319、DCDC2、SLC6A3/DAT、DRD2、AP4E1、ELKS/ERC1等基因的遗传表达有关，这些基因的突变与发展性言语障碍、特异性语言障碍、阅读障碍、言语声音障碍、注意缺陷多动障碍等相关。重要的是，最近的研究突破表明，GNPTAB、GNPTG和NAGPA中的特定遗传变异都与细胞的溶酶体过程有关，已有发现导致II型和III型常染色体隐性纯合子突变的溶酶体过程与口吃病例特别相关。总的来说，口吃的基础可能涉及特定遗传背景(如溶酶体代谢途径)和大脑连接改变之间的关键交叉。然而，口吃相关基因是如何影响这些神经回路从而产生口吃语言的，目前还没有完全弄清楚。

基于以上问题，本文的研究有两个目标。首先，使用功能连接和基于图论的新方法来描述描述口吃(PWS)患者的大规模皮层网络。其次，使用先前报道的口吃相关基因集，即Allen人脑图谱(AHBA;(Shen et al.， 2012)，进行遗传富集和相互作用分析。作者假设，定义口吃网络的连通性特征与基因表达水平的网络可以共同定位，这些基因表达水平在言语产生过程中会造成神经功能障碍的风险和脆弱性。换句话说，作者假设形成口吃的大脑网络和某些基因的拓扑分布之间存在高度重叠，这可能是口吃者大脑回路缺陷的一个可能原因。总的来说，回答这些问题可能有助于弥补在理解溶酶体代谢途径和大脑连接改变之间的关系。 

研究方法：

本文的研究使用了很多的分析方法，并且不同方法之间存在着很强的逻辑关系。因此，我们先梳理一下作者使用的方法以及使用该方法的目的，然后再介绍下作者是如何使用的。

首先，根据作者的研究问题一，需要确定支持口吃的功能网络，因此，作者使用了ALE-meta analysis通过以往的研究来确定支持口吃的神经底物。作者使用的是GingerALE 2.3.6工具包，使用了activationlikelihood estimate的方法来分析以往的口吃研究中出现的口吃者脑功能异常的区域。包含的文章包括了使用“stutter+task+fMRI”和“stutter+task+PET”搜索出的PubMed和Web of Science(2017年1月)中的研究。

入选标准包括:

(i)发表在同行评审的科学杂志上;

(ii)使用功能磁共振成像或PET技术来测量激活;

(Ⅲ)PWS组与NFC组的任务激活情况比较;

(iv)在标准立体定位空间(无论是Talairach还是MNI)报告了基于坐标的数据。同时，作者剔除了个案研究的结果。

同时，为了能够满足对与口吃相关的候选脑区的探索性分析，作者在GingerALE中使用了p < 0.001的宽松阈值，未做校正。

接着，在确定了一些脑区后，作者需要通过真实的数据集来测试通过ALE荟萃分析得出的脑区所构建的功能脑网络是否能够表征口吃表现。作者使用了这样几个数据集：       

1.健康成年人数据集(n=100来自大脑基因组超结构项目(Holmes et al.， 2015);平均年龄21.2岁;男性51%;右利手)；

2.儿童发育性口吃数据集(N=31;平均年龄6.45岁;男性52%;3.与儿童口吃样本匹配的两个对照样本(n=39和n=24;平均年龄6.24岁;41%的男性)。这些被试的数据采集参数和预处理过程都是标准的。

在确定好了口吃脑网络（ALEmeta分析结果，如图1的I中的a、b、c三个区域）的种子点以及准备好用于构建网络的数据后，接下来就需要构建脑网络了。作者第一步先计算了所有收集到的被试的静息态数据的灰质mask内的voxel-voxe的功能连接（pearson相关），使用FDR校正功能连接结果（阈值为0.001）。接着，作者将两种互补的图论方法应用到刚才建立起的全脑关联矩阵中，重点放在元分析中确定的感兴趣区。第一种方法是通过刚刚建立的全脑矩阵确定和作者在ALE分析中确定的口吃相关脑区中的体素存在显著关联的脑区，只要存在关联就代表与口吃脑网络有关（也就是图1中的strategy1）。第二种方法是利用这个全脑相关网络确定所有其他体素与口吃相关脑区的连接程度，与a、b、c这三个区域中的体素都存在功能连接，那么这个体素就标值为1，也就是图1中strategy2的3/3，与两个区域存在关联就标值为2/3，与一个区域存在功能连接就标值为1/3。作者这里其实利用的是图论中的度值的计算方法，作者用一个公式来表达了每个体素的加权值的计算方法：

WD代表weighted degree，即度值，使用体素i连接到目标区域S（s从1开始）的FC的功能连接显著的值进行加和，加和次数为m（a、b、c这三个区域，即把三个区域的连接可能性都加上）。这样算出来的值是一个加和。

作者通过这样一个计算来将其转化为每个体素到口吃相关脑区a、b和c的连接概率。其中FC_b二值化的全脑网络（即有连接就是1，没连接就是0），thr代表阈值，0就是不和口吃相关脑区任一一个存在连接，1就是和这三个脑区全连接。

图1 口吃相关脑网络构建和口吃、语言相关基因表达脑网络构建

在通过上述两种方法获取了口吃相关网络后，作者将口吃相关网络和一些已经较为认可的5个语言相关网络进行了overlap的比较。分别是听觉-运动整合网络、韦尼克网络、Broca F3的岛盖部网络、Broca F3三角部网络和Borca F3区的眶额皮质网络。作者通过提取口吃网络中每个体素在上一步得出的度值得分的强度除以相应语言网络的mask的大小，得到了口吃连通图与其他语言相关连通图的重叠指数。

最后，作者开始分析口吃脑网络和相关基因表达网络的共定位状况。作者利用先前所描述的与口吃病例相关的基因的先验知识，以及基于AHBA全基因组(蛋白编码)转录组的数据驱动方法，来寻找口吃的神经生物学基础下的皮层基因图谱。详细步骤如下，第一，作者研究了与口吃密切相关的基因，如CNTNAP2、GNPTAB、GNPTG和NAGPA，以及与语言和语言发展密切相关的基因，如FOXP2、ROBO1。作者从AHBA中获得这些基因的表达水平（图1的II中的第一张图），接着，对覆盖整个皮层的Desikan- killiany图谱的68个预先指定的大脑区域进行了AHBA转录谱的解剖学转换(Desikan et al.， 2006，包括20737个蛋白编码基因，基于对6名成人参与者的3702次大脑样本采集中的58,692个基因表达的测量)。通过计算相应向量间的欧氏距离，研究了口吃相关基因表达数据与语言相关基因表达数据之间的空间拓扑相似性。

然后，使用Desikan-Killiany图谱将口吃网络图转换为与AHBA数据相同的空间。口吃网络图的每一个体素都被映射到Desikan-Killiany图谱的一个区域(68个区域)，然后计算每个区域的平均值。然后，分析了口吃的成像表型和AHBA数据的整个转录组(20737个基因的皮层基因表达水平)之间的空间拓扑相似性。至此，作者构建了一个基于整个蛋白编码转录组的零假设分布，在该分布中，作者计算了口吃成像表型与特定基因之间的相似性p值。将转录组均值以上两个标准差作为统计显著性水平。

再验证了作者的主要假设后，作者还进行了基因本体与相互作用的分析。

使用过表达分析，可以了解可能的生物学过程或细胞成分与口吃相关基因连接组的遗传学相互作用。为此，作者采用了前一步得到的数据驱动的基因集和基因本体，使用GO二项测试来描述相关生物过程或细胞成分的基于基因注释的功能，指定“人类”作为参考列表，而前面步骤中的数据驱动基因列表作为分析列表。此外，使用interactome 分析法来调查已识别的基因之间的遗传相互作用，以调查超越它们在皮质中的空间协同定位的遗传功能关系和相互作用的证据。遗传关联的权重是基于来自共表达、共定位、遗传相互作用、通路、预测物理相互作用和共享蛋白域的相互作用研究结果。使用了图论中的节点介数指标，以确定感兴趣基因的特定作用。
研究结果：结果一：口吃脑网络

图2 口吃脑网络

本文的的ALE荟萃分析在大脑皮层的几个候选区域发现了口吃研究中的脑区，包括双侧中央前回、左侧颞上回、双侧颞中回、双侧额叶内侧回、右侧前扣带皮层、左侧岛叶和双侧下顶叶。作者在大脑皮质外也发现了两个脑区，一个在右壳核，另一个在小脑的右八区（基于AAL索引）。图2的I中展示了所有的皮层脑区，皮下组织和小脑区域未图示化，但包括在了所有的分析当中。

作者的ALE分析结果与作者在自己的数据集上验证的结果一致性很高，图2的II中展示了CWS（儿童口吃者）的全脑FC低于NFC（普通流畅儿童）的区域，可以看出和作者基于ALE分析结果，然后根据图论方法（即我们在方法部分所说的strategy1和strategy2）建立的口吃相关网络的重合度很高（图2中的stuttering network）。都发现，双侧听区、运动区、外侧翼区，特别是额顶盖、腹侧中央前回和中央后回、颞上回、前脑岛、颞下回，以及中线区域，如辅助运动区和中央额区等区域的功能连接异常。

并且，这些区域中有几个在与口吃相关的区域中扮演着重要角色，特别是额叶和顶叶的盖区(如OP4)对a、b、c这三个区域之间起着相互连接的作用。

结果二：与语言相关脑网的重叠分析

研究发现，口吃连接网络与其他大型语言相关网络共享皮层拓扑结构(图3-I和3-II)。听觉-运动整合区、Broca s F3岛盖区和Wernicke s区与口吃网络高度重叠。其中，图三I展示了作者所使用的5个语言脑网络，图三II展示了作者根据重叠指数计算的结果。

图3 口吃网络和其他语言网络的重叠分析

 结果三：口吃网络拓扑结构与大脑GNPTG基因表达存在交叉

通过分析了吃基因表达水平和语言相关基因之间的皮层相似性，发现NAGPA、GNPTG、GNPTAB和CNTNAP2，特别是NAGPA、GNPTAB和CNTNAP2表现出高度的相似性(共表达矩阵中的黑色方块;图4-I)，而ROBO1和FOXP2形成单独的聚类(共表达矩阵中的浅色方块;图4-I)。重要的是，重要的是，当所有转录组数据都考虑到口吃连通性图谱的相似性评价时，只有GNPTG在口吃相关基因和语言相关基因中达到了统计学意义（图4-II）。并且，GNPTG基因的表达水平脑网络图与口吃连接图(图4-II和图4-III)具有高度的相似性，特别是在听觉-运动整合区域(图4-III中的星形符号)。

这说明，GNPTG基因在皮层的表达水平和口吃脑网络存在显著的重合，并且听觉-运动整合功能区是其集中重合的区域。这一区域在口吃脑网络研究中同样是多个研究发现的区域，可能提示了口吃的基因表达和功能异常的重要神经底物。

图4 口吃网络拓扑结构与人类皮层的遗传表达水平的共定位分析结果

结果四：口吃网络与溶酶体和神经轻链功能有关

在上一个分析结果中，研究发现出来GNPTG，其他与语言相关的基因的皮层表达和口吃脑网络也存在显著的相似性。因此，为了评估该基因组是否存在遗传功能的过度表达，作者进行了针对生物过程的GO分析。结果发现，与口吃皮质网络共定位的基因表达不仅在溶酶体相关功能(如蛋白定位到溶酶体)(图4-IV中的绿色高亮部分)，而且在神经轻链细胞骨架组织(图4-IV中的红色高亮部分)中高度富集，具体涉及NEFH、NEFL和INA基因。与一般细胞过程相关的其他生物学功能也被发现，如线粒体相关转运、蛋白膜靶向和糖酵解(见图4-IV中完整的生物学过程列表)。

以上主要发现表明，溶酶体基因和神经轻链基因可能参与了口吃的大脑病理生理过程，因此，通过相互作用组（interactome）分析，探讨GNPTG、NEFH、NEFL和INA基因是否在空间皮层域之外表现出遗传相互作用。

结果发现GNPTG(图5-I中的绿色节点)与NEFH、NEFL和INA(图5-I中的灰色节点)通过特定的遗传相互作用(图5-I中的红色和橙色节点)相互连接。与之相关的是，CDK5和SNCA在支持GNPTG和神经轻链组织基因之间的遗传影响方面表现出较高的介数值(图5-I和5-II)。这说明，SNCA和CDK5在这个过程中扮演了重要的中介连接角色。

图5 GNPTG与神经轻链基因(NEFH、NEFL、INA)相互作用的介数图

 总结：

总而言之，本文通过“大海捞针”式和“按图索骥”式的分析方法，通过对大量已有研究结果的综合分析，通过网络的分析方法结合基因组研究的相关方法，有效的对基因表型研究和大尺度脑网络研究的结果起到了推进性的作用。

本研究，有助于弥补功能性神经网络和先前与口吃相关的基因突变之间的差距。基于对儿童和成人口吃者的功能连接数据和基因表达图谱的分析，研究发现口吃相关的功能连接网络与溶酶体转运基因GNTPG的基因表达共定位。这个基因和其他类似基因的突变嵌入在大脑网络的皮层拓扑结构中，表明这些突变可以调节这些网络的功能。

听觉-运动整合网络非常容易受到与GNPTG -溶酶体功能障碍相关的神经回路功能障碍的影响。这些结果首次证明了基因突变与口吃者大脑异常连接之间可能存在的因果关系，并进一步提出了与神经纤维相关的生物学通路，这可能有助于解释导致持续性发育性口吃的神经机制，是一项意义重大的口吃析因研究。

原文：Neurofilament-lysosomal genetic intersections in the cortical network of stuttering

微信扫码或者长按选择识别关注思影