Science：Julich-Brain：一个新的细胞结构水平的概率脑图谱

细胞结构是人类大脑在微结构上出现分离的基本生物原理，但就目前为止，还没有出现一个考虑到细胞层面及个体差异的人类脑图谱出现。本文介绍了Julich(德国于利希）实验室的最新研究成果——Julichu-Brain，这是一个包含皮层区域和皮层下核的细胞结构图的3D图谱。该图谱以概率的方式考虑了个体大脑之间的差异。除此以外，构建这样的一个脑图谱是需要大量的数据和工作量的，开发过程中需要开发嵌套的、相互依赖的工作流（working pipeline），使用该工具流可以检测大脑区域之间的边界、数据处理、追踪来源，以及灵活地执行不同工作流程，以处理不同空间尺度上的大量数据（这个工作流可能在日后起到更多的作用，开发更多的研究成果）。使用间隙映射的方法可以补充皮层映射，以实现完全的皮层覆盖。并且本图谱的开发考虑后续的动态进展，随着图谱绘制在不同方面的进展的调整，本图谱可以支持健康受试者和患者的神经影像学研究，以及建模和仿真，并可进行互操作，以连接其他脑图谱和资源。文章发表在Science杂志。

人类大脑的微观结构分离图是理解大脑功能、功能障碍和行为的生物学基础的关键。细胞结构（例如，细胞的排列、分布、组成和分层）是大脑微观结构组织的基础。它与一个区域的连通性模式及其功能密切相关。此外，在细胞结构层面可以涉及到大脑组织的多个方面，如脑皮层纤维结构、分子结构、基因表达，而且还包括了大尺度的激活或静息网络和更多的宏观层面的大脑信息。也就是说细胞结构层面的图谱可以作为接口来表示和整合大脑组织的不同方面。研究者们普遍认为，在探索大脑组织时，必须采用多面但一体化的方法，因此，不同层面的图谱给研究者们带来了更多关于大脑的信息。在这种背景下，细胞结构层面的脑图谱是非常重要的。

1909年的布罗德曼细胞结构图是最早的细胞结构图之一，至今仍被广泛使用。但是它有几个缺陷，例如，主体间的变异性在这张脑图谱中没有被反映出来。并且，与布罗德曼脑图中的43个区域相比，当前大量的研究已经表面皮层区域的数量在180个或更多的范围内。皮层下的结构也有同样的细节，但没有被包括在布罗德曼脑图中。要在具有足够空间分辨率的细胞结构图中捕获不同区域和皮下核团组织的细胞结构，就需要对每个大脑的数千个组织切片进行分析和处理，而且要具有一致性的高质量数据。在这种背景下，Julich和Dusseldorf实验室的研究者们创建了Julich- brain图谱(图1)。这是一个包含皮层区域和皮层下核团的细胞结构水平的概率脑图谱。研究者们在上世界90年代中期就开始了这一努力，最近又诉诸于“crowd-source strategies（众包策略，就是很多研究者、很多不同资源分开处理特定的工作部分，可见这样一个图谱的工作量之大）”(但是是在高专业水平和深厚专业知识的基础上)。脑组织的制备、微观结构的制图、分析和复杂的数据处理是数据、时间和劳动密集型的，特别是随着样本量的增加和空间分辨率的提高。因此，单个研究人员或小团队不可能在可接受的时间框架内提供具有足够细节的全脑地图。不过，本世纪快速发展的计算能力和存储能力，以及数据处理的改进算法和工作流，使得研究者们现在可以在高空间分辨率下实现更快、更鲁棒的处理。

图1 Julich-Brain的皮层及皮层下核团组织

但是，并不是所有数据集和分析都能从显著改进的数据采集技术中获得同样的好处。本文所介绍的图谱中的细胞结构绘制工作始于25年前。这些大脑已经经过了组织学处理，以后既不能获得新的高场MRI数据，也不能获得更高分辨率的体素图像。MRI数据的质量因此受到采集时可用质量的限制。这有时会限制现代成像工具和技术的使用，因为这些工具和技术通常是针对当前可用的数据质量。同时考虑实际数据集和更多历史数据集的特定数据处理策略是必须的。为了确保在整个数据处理周期中数据和处理步骤的一致性、可再现性和一致性，本图谱的创建过程中从一开始就形成了自动的、灵活处理的和可重复的工作流。

因此，研究者们开发了一个模块化的、灵活的、自适应的框架来创建概率的细胞结构图，这些图来自于对每个区域的10个死后人类大脑的分析(图2)。图被对齐到两个广泛使用的立体定位空间，即MNI-Colin27和ICBM152casym空间，并进行叠加。在一个共同的立体定位参考空间中，Julich-Brain图谱可以比较不同研究获得的功能激活、网络、基因表达模式、解剖结构和其他数据(图3)。该框架依赖于长期以来处理大脑结构解剖的专业知识，各种皮层和皮层下区域的细胞结构映射，以及利用局部集群和超级计算机开发鲁棒和自适应工具的计算能力。

图2 制作Julich脑图谱的工作流

注释：(A)为了恢复死后大脑的三维形状，根据未失真的MRI数据集，采用不同尺度下的线性和非线性处理步骤，获得了块状的分割图像。对数字化的组织学图像进行了光学不平衡的修复和校正。使用一个刚性的截面到截面的对齐方法计算，以创建一个第一个近似的三维重建。它的作用是通过刚体变换将MRI数据集对齐到相应的切面。用弹性方法将切片与MRI切片进行非线性配准。作者将这些图像配准到两个标准空间中，MNI-Colin27和ICBM152casym空间中。

（B）细胞结构在连续的组织切片中进行分析，覆盖每个区域的完整范围，并用灰色指数来表征。将区域的等高线提交到数据库中，进行三维重建和拓扑归一化。对这些区域进行线性和非线性变换并叠加形成细胞结构概率图。

(C)计算基于体积和表面的最大概率Julich -脑图谱。为了有效地组织密集的计算，研究者们实现了一个数据处理管理系统，该系统允许跨多个CPU核心对大量数据集进行分布式处理。它被设计成可以很好地从一个单核计算机系统扩展到高性能计算环境中的数千个计算节点。

Julich脑图谱是基于23个死后大脑的组织学切片(女性11个，男性12个，平均年龄64岁，年龄范围30-86岁，平均死后时间为12小时)，这些切片来自德国杜塞尔多夫大学解剖研究所人体供体项目。用福尔马林浸泡，对固定脑进行了磁共振成像，然后使用石蜡包埋，用切片机连续切成20微米的切片。细胞体用改良的Merker染色法染色。组织学切片用10微米的平板扫描仪进行数字化，降采样到各向同性分辨率20微米，框成独特的图像尺寸，并以无损压缩的灰度图像的形式存储。两个大脑（通过MRI扫描获得了一个全脑图像，通过解剖学方法重建了一个全脑图像）组成完整的系列(BigBrain数据集;其中一篇已发表，BigBrain: An ultrahigh-resolution 3D human brain model. 2013年Science)，每一个部分都被染色和数字化。其他的大脑每隔15个section进行染色。这一共产生了超过24000个组织学切片。组织学处理包括安装切片，去除小褶皱和皱褶，染色会导致一定程度的局部变形、损伤或染色不匀，这些都是不可避免的，但可以通过MRI图像补充。并且，只有不到1%的切片存在不可修复的损伤(例如，大量组织的丢失)，仅有20-30%的切片显示小的局部损伤。为了校正组织学切片的畸变，研究者们使用了相应的MRI图像进行了三维重建(图S1A)。对组织学切片图像中的大损伤进行人工和半自动校正。

表S1 所有23个大脑的被试信息和脑切片方向信息

耗时的修复和处理大脑所需的大量计算需要使用超级计算机来完成工作流程。由于数据集数量大，加上整体重构工作流的复杂性和多样性，研究者采用了时间和资源平衡的计算处理。这使得大数据集的高效管理、存储和源头跟踪成为可能。在BigBrain 1重构的基础上，开发了一种适用于BigBrain 2重构的工作流，其中包含一个复杂的数据源跟踪系统。它作为通用数据流管理系统的基础，允许将重新计算限制在那些受后续修复影响的图像上，而图像保持不变，从而显著减少计算时间。此外，BigBrain 2数据集的管道与整个工作流程紧密相连，使用方式与其他21个死后大脑相似。为了恢复脑体积的原始形状和拓扑结构，需要计算组织切片的三维重建(图S3)。作者在补充材料中对这些过程进行了详细的描述。

图S1 对大脑图像的重建和标准空间的配准流程（流程描述看前文）

图S1B 组织切片中的细胞结构定位，此图是对图S1A中第一部分的补充

人类大脑显示出不同模式的脑沟和脑回，以及不同受试者之间在细胞结构区域的形状、定位和表现上的差异。为了使大脑可比较，首先将3D重建的组织学数据集配准到单个受试者MNI-Colin27模板的立体定位空间(图S3)。与从许多大脑数据集(如MNI305模板)中提取的模板相反，个体标记的大脑显示了详细的(但不具有代表性的)解剖结构，因此允许将死后大脑的大体解剖结构精确地配准到每个区域。由于均值组数据集在神经成像界得到了广泛接受，因此本文的研究者们也计算了配准至ICBM2009c（即ICBM152casym）非线性非对称空间的非线性转换矩阵。该模板代表了MNI-Colin27大脑具体的解剖结构与更一般但更平滑的MNI305模板之间的组合。通过将3D重建的组织学数据配准至这两个标准空间的脑图，生成标准的、被广泛使用的标准空间图谱，Julich脑图就可以被研究者们广泛使用，并且被应用众多的大型脑科学研究项目，如人类连接组计划、UK Biobank计划等。

为了开发一个包含皮层区域和皮层下核的图谱，作者们使用了基于容量的方法，为皮层和皮层下结构提供了一个一致的配准框架。弹性三维配准采用了匹配良好的参数集，该参数集也用于二维配准。该方法在死后和体内数据集显示了高可靠性。将所有死后大脑配准到MNI-Colin27和ICBM152casym标准空间大脑中，3d重建数据集和模板的折叠模式和形状相似(图S3)。每个三维重建的组织数据集的三维向量转换矩阵被存储，并应用于随后绘制的细胞结构区域。

图S3 对组织切片的3D图像重构和标准空间配准

根据一个结构的大小和形状，每15到60个切片就会在整个细胞结构区域内绘制一次。使用图像分析和统计标准来确定皮质区域之间的边界，以使绘图具有可重复性。在数字化切片中标记出边界的位置，并用封闭的多边形(等高线)标记出其在切片中的范围(图S4)。皮质下核在组织学切片中识别核的外边界，并标记为封闭的多边形线。等高线也被用来检查地图的整个范围的质量(图S4)。

图S4 对皮层和皮层下的皮质结构的细胞结构的绘制

注释：作者们使用了图分析驱动区域的拓扑校正原理。区域的范围用等高线表示(a、b中为红线)，区域的等高线在相邻的组织切片中显示。本图中以ACC区域的细胞结构划分为例，图(A)显示了对所有大脑的划分的叠加的过程，图B显示了对每个大脑的特定区域的图表分析的过程，图（C）显示了叠加可以识别划定区域的突变的过程，这个过程可能是手工识别完成的。

下一步，单独计算每个区域/核、半球和大脑的收缩修正体积(详见补充资料)。对现有的120个脑区进行分析后发现，这些被试的大脑之间在体积上存在相当大的差异(图S5)，但在整体水平上，两个半球之间以及男性和女性大脑之间的差异都不显著。表S2提供了关于面积体积的完整信息。volume的列表与区域和核的概率地图一起是一个资源不断增长的过程，通过HBP的知识图提供并不断更新(参见https://ebrains.eu)。主体间差异程度的比较表明大脑区域之间存在差异(图S5)。例如，高变异性(即顶叶上半部、顶叶44区、顶叶45区，概率值低)，而颞叶初、次级视觉皮质的枕极区(BA17/18)和Te3区变化较小。

图S5 MNI-Colin27大脑中由男性和女性大脑变异系数(cv)估算的主体间体积变异性

注释：不同的大脑区域差异很大。对男性和女性大脑的比较表明，在分析样本中存在局部差异，但差异并不显著。

以前的和正在进行的制图项目产生了超过10,616个xml文件，其中包含85,210条等高线，有3,737,771个点，总长度为1961米。使用开源版本控制系统Subversion来管理具有等高线的数据集，该系统可以自动地对文件和目录进行人工标注，并记录区域边界的本地化如何在整个分析周期中发生变化的完整历史记录(图S1B)。当一个新的脑图项目需要重新分析现有的脑图时，可能会发生变化，这个过程将被记录并保留下来。

这些所有的图像都被配准至前文所述的两个标准空间的脑图上，使用所有23个大脑配准后的图像创建基于体素的概率图谱，然后映射至皮层系统，通过将概率值投影到皮层表面上，一个基于表面的细胞结构表征的皮层脑图被计算出来（图S6）。数值范围为0.0到1.0，以表明该体素中某个区域或皮下核团被定位的概率(0%到100%重叠)，并提供一个测量区域从大脑到大脑在定位和范围上的变化，即inter-subject可变性。概率地图相互重叠，即参考空间中的体素通常可以被标记到多个区域，每个区域都有明确定义的概率，总和达到100%(图S6)。研究发现，约50%的体素与单个区域/核团相关，35%与两个相关，15%与三个或更多相关。

图S6 MNI-Colin27空间皮层水平颞叶区域细胞结构概率图

注释：(A)颞侧回的初级听觉区Te1.0、Te1.1(54)和次级听觉区(te2.5 /2、TeI、Te3、(54)、STS1和STS2(55)的脑图。每张图都是基于十个大脑的。

(B) STS1和STS2地区的白色箭头所示的概率图重叠，即，许多参考大脑的体素具有多个区域的概率。概率图捕捉了这种不确定性，而最大概率图MPM

(C)提供了一个简化的视图，其中每个体素与最大概率的区域相连。lf侧裂，sts颞上沟。

为了能够让研究者更清楚的了解Julich Brain 相比传统脑图谱的优势，研究者计算了Julich脑图和布鲁德曼脑图的比较，以颞叶听觉区域的分割为例：

图S7 颞叶听觉区的分割颞叶

赫氏回(HG)有初级听区Te1.0、Te1.1，颞上回(STG)和颞中回(MTG)有高级听觉区(Te2.1/2、TeI、Te3、(54)、STS1和STS2。图(B)是利用最大概率图谱创建的mask。图A中的细致分割说明了利用细胞构筑的地图比宏观分割的空间精度更高:Te1.0和1.1地区位于HG,其中还包括TeI区域的一部分。STG包含许多不同的高级听觉区域。虽然STS2和Te3位于同一回，但是在细胞结构上，它们比STS1和STS2更不同，后者占据不同的回。

图S8 在the MNI-Colin27脑图上呈现的Julich Brain的皮层分割图
目前，大约70%的皮层表面已经被完成并被出版的绘图项目所覆盖。然而，仍有一些区域没有被绘制出来，并代表未来研究的项目。为了实现对大脑皮层的全脑覆盖(图S8)，大脑皮层中尚未绘制出细胞结构分割的部分被合并成若干空白地图，将这些未绘制出地图的区域汇集到一个大脑区域中(图S9)。

图S9 MNI-Colin27大脑间隙图及其边界的表面表示

在未来的进展中，新的修改将被跟踪捕获和记录，新的映射将不断地用新的结果替换空白映射。因此，本脑图不是静态的(例如，Brodmann的地图)，而是一个处于动态变化的脑图。间隙映射的引入允许计算覆盖整个皮层表面的分区，并将每个位置简单地分配到一个皮层区域。随着皮层下核团的概率图越来越多，间隙图构成了整个大脑的人类图谱。Julich-Brain脑图可以在其他脑图谱和具体研究中应用,例如,研究健康受试者和病人的激活的微观结构有关的神经影像学研究(图3)。此外,Julich-Brain有助于基于微观结构的大脑分割。该图谱可能为生成大脑活动模型开辟新的途径，例如在癫痫研究中，使用个性化的大脑模型用于预测癫痫发作。模块化、灵活、可扩展的工作流涵盖了从图像采集到三维重构和概率地图生成的广泛步骤，可以在多个研究领域中应用这些步骤。该系统框架(或其部分)可扩展到其他物种的大脑，并可处理用免疫组织学等其他技术标记的切片图像。新的模块可以添加到工作流程中，例如，绘制基于深度学习的大脑区域（可见，Julich Brain的产生只是在这样一个科学生产框架下的一个重要的研究成果，以后可能还会有更多的成果出现，这说明一个可拓展、可重复和稳定性高的工作流是多么的重要）。

图3 Julich Brain 的应用

注释：(A)人脑HBP图谱中显示基于网络的图谱在Julich Brain中的细胞结构。

(B) JuGEx能够分析细胞结构图

(C)结合差异基因表达，并连接和探索基于DTI的连通性(如左Broca s 45区)。

(D)在一名脑损伤和失语症患者的数据集上叠加Broca区的概率图。该脑图可以精确地描述神经影像学发现的微观解剖位置。

并且，Julich-Brain atlas是一个免费的资源(www.jubrain.fz-juelich.de)。脑图已经可以通过不同的工具和网站,例如,SPM解剖学工具箱,FSL(https://fsl.fmrib.ox.ac.uk), FreeSurfer (https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu)和EBRAINS（欧洲人类大脑的研究基础设施建设项目）,HBP (https://ebrains.eu/services/atlases)。这些图谱可以通过JuGEx工具与基于DTIbased的连通性数据(图3C)和艾伦脑科学研究所(https://alleninstitute.org/what-we-do/brain-science)提供的基因表达数据(https://alleninstitute.org/what-we-do/brain-science)进行链接，从而构建人脑组织的多模式视角(图3B)。未来的人脑研究也必将是往这一方向来发展。