AJP：焦虑障碍神经因素的年龄差异：对习得性威胁反应的fMRI研究

虽然青少年和成年焦虑症患者对威胁的神经反应相似，但在一些功能磁共振成像(fMRI)研究中发现了年龄差异。本文在对恐惧进行评级以及回忆模糊威胁时，比较了患有和不患有焦虑症的青少年和成年人的大脑功能差异。

方法：

对200名年龄在8-50岁之间的无用药个体进行评估，其中包括93名患有焦虑症的被试。在诊所接受了威胁感知和消除的辨别测试。大约3周后，完成fMRI范式，对与已经消除的威胁线索具有不同程度相似性的变换刺激，进行威胁评级和外显记忆任务。

结果：

首先，随着年龄的增长，与患有焦虑症的被试相比，健康被试在处理与威胁相关的线索时，杏仁核与内侧前额叶皮质(VmPFC)有更大的连通性。其次，随着注意力和大脑区域的不同，年龄调节了在激活方面的诊断差异。当对恐惧进行评级时，在成年人焦虑组和健康组之间，vmPFC的激活情况有所不同。相反，当对恐惧刺激回忆时，在青少年焦虑组和健康组之间，下颞叶皮质的激活有所不同。

结论：

与先前证明焦虑症的与年龄相关的研究不同，本文确定了年龄差异。可能反映了本研究关注于晚熟的心理过程，特别是对模糊威胁的评估和外显记忆的测试，为焦虑的神经发育角度提供了新的证据。本研究发表在American Journal of Psychiatry杂志。

本文重点

     fMRI研究往往由于考虑到数据本身的复杂性和数据量的大小，较小使用复杂的统计模型探索较大范围内不同因素的交互作用，例如4-way interaction或者更阶的交互作用。虽然低阶的设计模型可以更好的解释，但是简单模型本身就限制了我们对复杂问题的研究假设和探索力度。因此，学会如何使用fMRI手段探索更高阶的交互效应和复杂问题是至关重要的。本文的group-level的建立通过混合效应模型的使用的较好的探索了这一问题，是可以借鉴的典范文章。

     与此同时，gPPI作为对SPM中提出的PPI模型的一种推广，在建模方面具有更加便捷的操作性，可以很好的考察任务功能磁共振研究中不同脑区间的功能连接强度，是探索任务加工过程中功能连接强度的重要手段之一。本文对该方法的使用同样值得效仿学习。

      注释：文章中所说的威胁消除任务是情绪研究中的常用范式，该范式可以通过对表情线索的不同程度的连续调节达到让被试对之前所观看的具有危险性情绪的图片或者视频的恐惧性记忆逐渐消退的效果。该任务往往是以参数调节的方式的实现的。

青少年焦虑症预示了成年焦虑症的风险，这可能反映持续性的脑功能障碍。然而，大多数青少年焦虑症在成年后缓解，有些焦虑症是在青少年时期之后才开始。因此，检查晚熟能力的功能磁共振成像(fMRI)研究可以揭示年龄差异。事实上，对由外显记忆及消除威胁线索诱发的恐惧进行评级的范式中，已经显示出了这种不连续性。本文使用该范式，检查了患有焦虑症和没有焦虑症的个体的大脑功能与年龄相关的差异，更清楚地解释了上述不连续性。

      威胁条件反射为这项研究提供了一个有用的背景。当中性刺激与厌恶刺激配对出现时，威胁条件反射就会发生，导致中性刺激获得唤起防御行为的能力。在发育和跨物种方面的研究表明，青春期前杏仁核相关的一些功能成熟，包括学习和注意力与该现象相关。在患有焦虑症的青少年中，以前的研究表明，这种回路的扰动在生命早期就开始，并持续了下来。相反，对前额叶皮质(PFC)的研究发现，青少年和成年焦虑症在PFC支撑的功能方面具有差异，例如对威胁消除后的持续维持能力。此外，晚熟方面的大脑环路研究证明这是灵长类动物特有的功能，例如对消除的威胁和模糊威胁线索进行有效的分类。在分类过程中，不同的杏仁核-PFC回路功能障碍在青少年和成年人焦虑症中表现出来，例如由模糊的威胁线索触发的主观评估或陈述性记忆。为了评估这种可能性，fMRI实验可以使用混合了已消除的威胁和安全线索特征的刺激，对模糊性进行参数化建模，从而绘制焦虑症神经因素的年龄差异图。

为了检验焦虑症的年龄差异，本文采用了一个经过充分验证的实验范式。被试对模糊刺激的恐惧和记忆进行评级，从而对模棱两可的线索进行分类。文章调整了范式，以重复更多的刺激，并允许在连续的范围内进行评级。评估群体在刺激特异性和注意力特异性反应上会表现出这种差异，这些调整增强了统计能力，会形成期望表现出与任务特征的高阶交互作用。本文检查了200名不服用药物的志愿者，并将年龄视为一个连续变量，以最大限度地提高统计能力，同时应用相对保守的统计阈值来限制I型错误。

基于之前的研究，本文假设青少年和成年焦虑症的fMRI响应在晚熟的、最近进化的神经环路中表现出差异。作者认为，与年龄相近的焦虑症患者相比，这一回路在健康的成年个体中表现更强，从而扩展了先前关于成年焦虑症的研究结果。

进一步假设，在健康和患有焦虑症的成年人之间，杏仁核和腹内侧额前皮质(VmPFC)之间的功能连接有所不同，这也扩展了之前的研究结果。最后，尽管现有数据显示青少年焦虑与成年焦虑的模式不同，但因数据有限，对青少年的假设不如成年人准确。因此，根据稀疏和不一致的研究结果，青少年和成年焦虑症具有不同模式这一预期似乎得到了有力的支持，既包括多模联合皮层激活，以及杏仁核-vmPFC的功能连接，而对于青少年的诊断差异的预期则不够明确。因为缺乏以往研究证据的支持。

方法

被试

8-50岁的被试参加了心理生理学评估和fMRI实验。初次纳入共327名被试(健康组172人；焦虑组155人)，排除40人，原因是在首次厌恶刺激出现之前（健康组1人；焦虑组6人）或之后(健康组7人；焦虑组16人)或因技术问题(健康组6人；焦虑组4人)中断。

249名被试(76.15%)返回接受功能磁共振检查(健康组136人；焦虑组113人)。排除了49人数据，原因是技术问题(健康组9人；焦虑组3人)、MRI中断(健康组1人；焦虑组2人)、头动过大(健康组2人；焦虑组4人)、表现不佳(在每种情况下＞25%的试验无反应：健康组12人；焦虑组9人)，或两次实验间隔时间过长(健康组5人；焦虑组2人)。最后，总共200名被试(健康组107人；焦虑组93人)完成了实验和数据分析。

通过对青少年(＜18岁)和成年人(≥18岁)的半结构化访谈进行诊断，患有焦虑症的被试(N=93)符合DSM-5标准，初步诊断为广泛性焦虑症、社交焦虑症或分离性焦虑症(和/或成年人惊恐障碍)。所有被试都没有服药，健康被试没有任何精神障碍。

研究被试的人口学和临床特征见文中表1。为了进行假设检验，在统计分析中，年龄被视为一个连续的衡量标准。然而，当在分析中观察到与年龄有显著相关时，使用事后比较中位数(中位年龄17.29岁)来阐明患者-对照组的差异。为简单起见，术语“成年人”指的是年龄中位数以上的被试，而术语“青少年”指的是年龄中位数以下的被试。值得注意的是，尽管在仅限于成年人的分析中，焦虑在女性中更为常见(x2=10.83，df=1，p＜0.001)，但总的来说，焦虑与年龄（t=-1.41，df=198，p=0.16)或性别(x2=2.19，df=1，p=0.14)的相关性并不显著。诊断和年龄的交互作用与智商或两次研究间的天数无关(p值＞0.2)。

33名被试询问他们是否会在消失期之前(N=3)、在fMRI扫描中的消失回忆阶段(N=26)或在这两个阶段(N=4)期间接受厌恶的刺激，并被告知不会出现（这说明这些被试担心实验过程中出现的厌恶刺激对自己的身心健康造成影响）。焦虑症患者(N=23)询问的人数明显多于健康人(N=10)(x2=8.55，df=1，p=0.003)。成年人被试和青少年父母都签署了书面知情同意书，所有的研究程序都得到了National Institute of Mental Health Institutional Review Board的批准。

实验过程

心理生理学实验：

被试完成了“尖叫的女士”范例(图1A)。对威胁和安全条件刺激(分别为CS+和CS-)进行辨别，然后消失的过程中，记录自我报告和心理生理学数据。

fMRI实验：

大约3周后，被试返回，执行根据先前工作改编的消除回忆任务。被试在两种注意条件下（威胁评估和外显记忆）进行了威胁-安全辨别任务。具体地说，被试评估了他们目前对面部变形刺激引起的恐惧水平或进行回忆，刺激的形变是从消除的威胁(CS+)和安全(CS-)线索不同程度的连续变化中体现的(图1B)。

图1 实验范式

 数据分析

使用功能神经图像分析(AFNI)对数据进行分析。

个体水平：使用Afni 3d Deconvolve，建立三个一般线性模型来估计血氧水平依赖(BOLD)信号随着反应时间的变化，以及使用广义心理生理相互作用(gPPI)方法估计杏仁核与任务相关的功能连接。第一个一般线性模型使用AFNI幅度调制选项(AM2)产生两种类型的回归变量：平均反应时下的任务相关激活和反应时调节的BOLD变化。

另一种类型的一般线性模型应用gPPI方法来识别大脑区域，这些区域在功能上与杏仁核的连通性随着任务条件的不同而不同，模型分别以左右杏仁核为种子点，导致在个人层面上总共生成了三个一般线性模型。

组水平：

来自以下个体水平感兴趣的回归变量的系数被包括在四个组水平的分析模型中：反应时间调节的任务激活、平均反应时间的任务激活、左侧杏仁核的gPPI和右侧杏仁核的gPPI。所有的fMRI分析都使用了全脑体素测试，年龄被建模为一个连续变量，以最大限度地提高统计能力。分析采用3dLME的线性混合效应建模，包括年龄(连续)和焦虑诊断(二分法)作为被试间的变量，以实验间隔天数(连续)作为噪声变量（即协变量）。注意条件(二分法：威胁评估或外显记忆)和变形图像之间威胁相似性的线性和二次趋势都为被试内变量。线性和二次趋势基于每个图像的变形程度的权重，由正交多项式生成。 多重比较校正：

统计图包括灰质体素，根据＞90%的可用数据设定全脑校正阈值。初始体素阈值设置为p值0.001(双尾)。使用AFNI 3dClustSim工具对多重比较进行校正。利用AFNI 3dFWHMx，根据来自个体水平模型的残余时间序列估计空间自相关函数的参数，并在被试间平均(0.548465、3.91625、11.2995)。为了解释四个线性混合效应模型上的28个实验阶段的交互作用，校正后的阈值通过最短邻近聚类(NN=1)的全脑F检验双侧阈值确定，α设置为＜0.05/28=0.0018。基于蒙特卡罗模拟，确定以包含57个体素的cluster为阈值(890.625立方毫米)。所有测试都是双尾的，Alpha设置为0.05（这些描述即是AFNI中Alphasim校正的过程，这种校正方法本就是AFNI软件首先使用的）。

作者更关注于综合交互检验的结果，因为它们最准确地反映了研究设计和年龄、诊断和任务因素之间的相应假设。因此，AFNI 3dClustSim中α被设置为0.0018，反映了总体比较下的显著性水平达到0.05（即使用Bonferroni校正法，进行了28次检验的p值校正）。这个阈值基于上述四个模型的两个四因素和五个三因素交互作用确定(即，4x[2+5]=28)。

双因素与诊断的交互作用结果被报道，但没有解释，因为本文的重点是高阶交互作用。为了可视化交互作用，提取了每个cluster的平均系数值，通过事后比较分析组间差异。如上所述，在所有的分析中，年龄都被建模为一个连续的回归变量。然而，数据是基于中位数(中位数年龄17.29岁)绘制的。

结果

心理生理学实验

被试的皮肤电导反应数据显示出现了恐惧条件反射和消失。此外，与健康被试相比，有焦虑症的被试受到的刺激会引起更大的恐惧和皮肤电导反应。没有其他与焦虑相关的差异。

功能磁共振成像实验

任务表现：

对于反应时间，变形刺激在两种注意力条件下会引起不同的变化趋势。因此，评级和记忆涉及不同的心理过程。此外，对于评级数据，年龄差异调节了注意力条件间的焦虑差异。

与任务相关的激活：

在平均反应时间的分析中没有四因素交互作用。然而，有三个三因素（焦虑-年龄-注意）交互显著的cluster：一个vmPFC的cluster(图2)和两个颞下回cluster(图3)。在vmPFC中，在评级任务中，年龄调节了焦虑组的差异，但在记忆任务中却没有。在威胁评级任务中，vmPFC的激活在健康成年人和焦虑成年人之间存在差异，但在青少年之间没有差异（图2B)。在较大的颞下回cluster(263个体素)中出现双分离，其中注意力调节了诊断和年龄的交互作用。与健康成年人相比，焦虑症患者在评级任务中表现出更大的激活，而记忆任务中没有，在青少年中，焦虑症被试在记忆任务中表现出更强的激活，但在评价任务中无明显激活。

图2 腹内侧前额叶皮质的激活

图3 右侧颞下回皮质的激活

注意力-诊断交互作用在补充材料S2中列出。总体而言，vmPFC、角回、小脑和前颞叶皮质出现了一致的模式。注意状态调节了与焦虑相关的差异，因此在威胁评级方面出现了显著的组水平差异，但在记忆方面没有出现显著差异。
gPPI

全脑校正的左杏仁核种子分析显示，对于不同的变形刺激，在vmPFC中具有焦虑-年龄-线性斜率的交互作用（图4）。在事后分析中使用了中位数划分年龄，与焦虑症成年人相比，健康成年人的线性gPPI斜率更高，青少年则出现相反的模式。未见右侧杏仁核为种子点时出现功能连接出现。当控制性别和指示语后，这些发现仍然具有统计学意义。

图4 左侧杏仁核与腹内侧前额叶皮层的连接

讨论

本次研究发现的两个研究结果可能会影响神经发育理论。首先，与患有焦虑症的成年人相比，健康成年人随着刺激越来越类似于安全线索，显示出更多的杏仁核-vmPFC正连接，而与患有焦虑的青少年相比，在健康青少年中观察到了相反的模式。第二，年龄调节了与焦虑相关的激活差异，其方式因注意力状况和大脑区域的不同而有所不同。这些结果超越了神经发育理论，也突显了功能磁共振成像研究方法的复杂性。

之前有相当多的研究使用面部观察任务来检查杏仁核和PFC在典型发育中的功能。在这些研究中，随着严格性的增加，显著的年龄差异未能复现。然而，杏仁核-PFC功能连接的发现具有一定的一致性，可能是因为杏仁核-PFC连接数据具有更强的可靠性。在本研究中的健康被试中，随着安全线索水平的增加，在模棱两可的面部暗示中，成年人表现出越来越正向的杏仁核-PFC连接。

这些数据扩展了之前关于杏仁核-PFC发育的研究结果。以前的研究表明，在观看面部情绪时，杏仁核-PFC连接具有年龄差异，而啮齿动物研究将杏仁核-PFC功能的年龄差异与威胁学习的年龄差异联系在一起。本文使用具有中性表情的面部图片研究条件反射和威胁消除，揭示了在消除回忆过程中杏仁核-PFC连接的年龄差异。将先前的面部情绪成像研究与啮齿动物的威胁学习研究联系起来，所有这些都揭示了杏仁核-PFC功能的年龄差异。

功能连接的结果也扩展了以前关于焦虑症的研究，特别是在成年人中，发现与健康被试相比，患有焦虑症的被试杏仁核-vmPFC连接性较低，尤其是面对包含高度安全线索的面部时。这些发现与焦虑症与安全提示信号传递不足有关的理论一致。暗示了在实验环境中不能维持安全线索的表征，也表现在焦虑患者的日常生活中，他们在无法识别安全信息时会感到恐惧。与成年人相比，青少年的数据显示出相反的趋势，与健康被试相比，患有焦虑症的被试的杏仁核-vmPFC连接性更强。

在疾病亚群中，例如青少年和成年焦虑症，这种相反的表现为交叉交互作用。相对于交叉模式，交互作用只在一个亚群中更多表现出疾病相关的差异。相对于关于青少年焦虑症的发现，本文针对成年人焦虑症的数据更紧密地复制了之前的研究结果。应该谨慎看待这些针对青少年的新的发现，并且需要复制这些发现。最近的神经生物学研究表明，青少年焦虑症的交叉交互作用频率越来越高。最后，值得注意的是，本文在年轻和年长的患者和健康被试中的连接有所不同。因此，无论是否患有急性焦虑症，都需要在没有药物治疗的青少年和成年人中进行复现结果。

vmPFC激活的差异表现在患有焦虑的成年人中，而青少年没有。这些发现类似于先前对情绪障碍的研究，在这些研究中，群体差异涉及vmPFC的失活。与成年患者相比，健康被试较少的失活或较大的激活可能反映了默认模式功能障碍，这种功能障碍可以通过基线条件的群体差异产生明显的任务失活。

在本文研究中，青少年焦虑患者与成年人焦虑患者相比，在颞下回激活的组间差异表现为不同的模式。这些差异发生在与线索相关的激活时，与颞叶对面孔反应的研究一致。青少年间的模式与另一项研究相似，此研究显示了记忆任务中的组间差异，并对颞下回面部表征的发育差异进行了大量的研究。

为了提高对高阶交互作用的敏感性，一项关于青少年社交沉默的研究使用了在消除回忆过程中收集皮肤电导反应作为回归量。另一项关于典型青少年发展的研究使用了威胁条件反射中的评分。虽然本文没有测量皮肤电导反应，但补充材料中的分析应用了这些先前研究的方法，使用了特定于被试的和特定于事件的反应时间作为回归量。未来的工作可能会同时测量反应时间和皮肤电导反应，同时探究激活、皮肤电导反应和反应时间之间的高阶交互作用。

本文发现还具有更广泛的意义。比较青少年和成年人的大脑功能可以更广泛地了解发育。其他关于焦虑症的研究已经显示出发育的连续性，通常是基础研究，局限于物种间保守性的早熟环路。相反，本文的结果表明，焦虑症的神经因素中存在与年龄相关的不连续性。在使用晚熟能力的任务上，年龄调节了与焦虑相关的差异，这得到了灵长类动物特有的多模联结皮层区域的支持。因此，纵向研究可以考虑这些能力的神经结构的发育变化是否可以解释焦虑症中与年龄相关的不连续性。

总结     

 本文使用gPPI的方法，在较大样本的研究中发现青少年焦虑症和成年人焦虑症之间存在不连续性，年龄调节了不同发育阶段的焦虑群体和典型发展群体在面对恐惧消退时的功能连接差异。主要体现在杏仁核-vmPFC功能连通性上，以及多模联合皮层中与任务相关的激活。作者采用了包含两个四因素和五个三因素的实验设计，力求探索高阶交互作用，虽然由于统计效力、组间差异等等因素的影响，效果不甚理想，但仍是未来学习的典范。此外，作者多次强调，本文关于青少年的研究需要其他研究学者进行复现，并通过纵向、病理生理学等多个角度去验证，所以，你还在等什么呢？感兴趣的话速速投入该研究吧，为探索人类的发育进程贡献一份力量！

doi: 10.1176/appi.ajp.2019.19060650

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