Neuron：老年人脑波在睡眠时失耦合：慢波-纺锤波同步、脑萎缩和遗忘

在非快速眼动(non-rapid-eye-movement，NREM)睡眠中，慢波振荡和睡眠纺锤波之间的耦合作用被认为是支持记忆巩固的。然而，在人类身上几乎没有证据支持这一理论。此外，这种动态耦合是否会因为晚年的大脑老化而受损，从而导致认知和记忆能力下降，目前还不得而知。美国加州大学伯克利分校的海伦威尔斯神经科学研究所的Helfrich等人对此进行了研究并在Neuron杂志发表。结合脑电图(EEG)、结构MRI和睡眠依赖记忆评估，我们在认知正常的年轻人和老年人中解决了这些问题。定向交叉频率耦合分析表明，慢波控制着睡眠纺锤波的精确时间协调，而睡眠纺锤波的质量可以预测夜间的记忆保留。此外，老年人中额叶内侧皮质的选择性萎缩预示了这种慢波-纺锤体耦合的时间不精确，削弱了一夜之间的记忆巩固并导致遗忘。因此，前额相关缺陷在非快速眼动睡眠的时空协调振荡中代表了一种解释与年龄有关的记忆衰退的途径。

1 引言

研究认为非快速眼动(NREM)睡眠振荡的精确时间协调，以支持记忆的长期巩固。在这些理论框架中，皮层慢波振荡(slow oscillations，SOs；<1.25Hz)、睡眠纺锤波(12-16Hz)和海马波纹(80-100Hz)形成了一个层次结构，能够把信息转换为长期记忆。特别是，我们提出SOs的去极化上升状态可以促进睡眠纺锤波和海马纹波的表达。这些非快速眼动振荡的耦合被认为在本质上支持了在长期记忆下跨时空尺度的信息传输。

然而，有限的证据支持这种海马记忆巩固的振荡相互作用模型。非侵入性脑刺激的研究结果表明，SO（慢波振荡）可以间接调节睡眠纺锤波活动。然而，SO-纺锤波同步化的机制关系以及它如何决定海马依赖性记忆巩固的成功或失败仍然是未知的。

有越来越多的证据表明，衰老会显著扰乱睡眠和夜间记忆的巩固。如果老年人的睡眠振荡耦合受到损害，那么是什么原因导致衰老的大脑降低了非快速眼动振荡的交互同步，从而导致记忆损伤呢？这个问题具有特殊意义，因为它可能揭示了一种目前被低估的机制(受损的SO-纺锤波耦合)，这种机制会导致老年人记忆衰退，如果被发现，将为临床干预定义一个新的治疗靶点。

在这里，我们通过结合结构MRI、多导睡眠和EEG（19导），以及评估年轻人和老年人的睡眠依赖海马记忆，来解决这些问题。我们的具体假设是，皮层NREMSOs和纺锤波的精确时间耦合，正如理论模型所预测的那样，有助于年轻人的夜间记忆保留，以及老年人是否存在这些振荡的时间不耦合，从而导致夜间记忆受损。此外，根据年轻人和老年人的证据表明，内侧前额叶皮层(mPFC)的灰质(GM)形态与SO的质量有关，且相同的mPFC区域是与纺锤波有关的SO的发生源。我们进一步验证了mPFC的结构GM完整性可以预测老年人SO-纺锤波动态耦合程度的假设。

我们实现了独特的非线性定向交叉频率耦合(CFC)分析，以及相位相关的测量，以捕获复杂的神经动力学潜在的SO-纺锤波同步关系。基于振荡的定时记忆传输理论，我们研究了SOs和纺锤波之间的准确时间支持记忆巩固的假设。基于SOs协调睡眠依赖记忆加工的预测，我们实现了一些方法来评估这种SO-纺锤波相互作用的时间方向性，并研究了这种方向性是否能预测年轻人和老年人的记忆巩固成功。最后，我们测试了与其他对照区域相比，mPFC区域内的GM萎缩是否与年龄相关的SO（慢波振荡）-纺锤波耦合的退化和老年人相关的记忆衰退有关。

2、方法

2.1重要的资源表

2.2被试

32名老人（73.7岁左右）和20名年轻人（20.4岁左右）参加了这项研究（见表S1）。表S1人口统计学和神经心理学测量

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2.3.1 实验设计与步骤

所有参与者都在晚上接受了情景词组任务（episodic word-pair task）的训练，并在10分钟后进行了一个简短的识别测试。然后，参与者有8小时的睡眠时间，从他们习惯的就寝时间开始。连续收集多导睡眠情况。参与者在醒来大约2小时后进行了一个长版本的识别测试。随后，我们获得了所有参与者的结构MRI。

2.3.2行为任务

我们利用了之前建立的依赖睡眠的情景记忆任务（图1A），参与者必须学习单词-无意义词的单词对（word-nonsense word pairs，如bird-jubu，鸟有意义，jubu无意义）。在编码过程中，参与者学习了120组单词-无意义词对。每一对的呈现时间为5秒。参与者在编码后立即进行标准训练。该词与之前学过的无意义词一起出现，还有两个新的无意义词也一起出现。参与者必须选择正确关联的无意义单词（如与bird配对的jubu），并在之后收到反馈。不正确的试次在一个可变的时间间隔后重复，并提供两个新的无意义单词。标准训练持续进行，直到所有试次正确反应。

在识别过程中，有意义词和4个无意义词出现：

（1）最初的无意义配对词（如bird-jubu），

（2）之前呈现过但与有意义次无关联（bird要和jubu配对，与其他有意义单词配对的如jubi），

（3）一个新的无意义词，

（4）指出探测词是新的单词。

图1 记忆任务和睡眠振荡特征

（A）情景单词对任务。参与者学习了120组词对。在编码试次中(左上角)，单词对呈现5秒。参与者在编码后直接完成标准训练(右上)，并在每次试次后得到反馈。识别再认测试(下)在短暂的延迟(10分钟，45个试次)后进行，然后在睡了一整夜(10小时，135个试次)后再次进行。

（B）老年人(蓝色)和年轻人(红色)在Cz电极上的非快速眼动睡眠EEG功率谱。灰色阴影区域表示低频和睡眠纺锤波频率范围的2组的差异显著。SO(<1.5 Hz，上面的地形图）和睡眠纺锤波(12-16hz；右边的地形图)的功率分布。值得注意的是，老年人整个头部的振荡能量明显较低。

（C）左上是一个老年人的睡眠示例图和Pz点的整晚频谱分析(左下)，检测到的SO和睡眠纺锤波事件叠加后的数量(白色实线)。右下：NREM睡眠中所有检测到的事件的峰值锁定睡眠纺锤波的平均值(黑线)。低通滤波后的事件(红色)突出显示睡眠纺锤波优先在SO的up-状态之前达到峰值。见图S1A。

（D）年轻人的情况，分析内容同（C），需要注意的是睡眠纺锤波振幅在SO（慢波振荡）峰后最大。

图S1 SO-纺锤波耦合特征。

（a）标准化的平均纺锤波间隔直方图。泊松过程意味着事件间的间隔呈指数增长。然而，睡眠纺锤波呈现非泊松分布。睡眠纺锤波的表达和/或产生，就像单个神经元一样，表现出不应期和节律性调节，这可能源于内源性的网络动态。直方图显示两个检测到的睡眠纺锤波事件从来没有立即跟随彼此。我们检测到该分布的前两个最大值(在1.13和2.78秒)，这与<1 Hz过程的节率调节一致，随后的睡眠纺锤波被1-3个SO周期隔开。注意，NREM睡眠中的大多数事件都是在小于5秒的范围内检测到的。根据这一发现，SO的峰值频率低于1hz，并且在组间没有差异。

（b）功率差异的分布。左：分层前我们观察到明显的低频(<4hz)功率差异。右：我们利用FFT将SO波谷锁定的原始时间序列转换成频域，然后对功率分布进行分层。

（c）对老人和年轻人重复了事件锁定的跨频率耦合分析。

（d）纺锤波出现和持续时间分析。我们测试了睡眠纺锤波出现或持续时间的差异是否可以解释任何观察到的耦合差异。

（e）为了解决组间纺锤波持续时间的差异，我们将持续时间定义为单个纺锤波超过检测阈值的时间。分析是基于单个峰值频率。

（f）我们重复了基于分层分布的事件锁定跨频率耦合分析，并再次观察到两者的显著非均匀分布，组间差异显著，证实了主要耦合方向的结果。

（g）对不同数量事件的耦合分析。耦合估计很容易被振幅和事件数的差异所扭曲。在非快速眼动睡眠中，年轻人比老年人更容易被检测到。

（h）线性弧度相关分析发现，每个参与者都表现出足够数量的事件来可靠地估计平均耦合方向和强度。因此，事件数的差异是可以忽略不计的，不会改变结果。

2.3.3 睡眠监测和EEG数据收集

睡眠监测记录在Grass Technologies Comet XL系统(Astro-Med)上。使用标准的19导的10-20系统和肌电记录(EMG)。EEG记录参考双侧相连的乳突，采样率400hz，范围0.1-100Hz。表S2是睡觉阶段矩阵。慢波睡眠(Slowwave sleep，SWS)被定义为NREM3-4阶段，而NREM睡眠包括2-4阶段。考虑到第2阶段并不总是表现出明显的活跃（图1C和1D），我们关注于SWS（NREM3-4）的所有相关分析。表S2与图1C/D结果相关的睡眠统计情况

2.3.4 MRI数据收集

西门子3T获得T1像，层厚1mm，176层，矩阵256*256，用VBM来检验感兴趣区的灰质体积。

2.4 数据统计分析

2.4.1行为数据

记忆识别或再认（recognition）的计算是命中率(hitrate，正确的单词-无意义词对)减去错报率（falsealarm rate，之前没出现过的词报告出现过）和引诱率(lurerate，与一个熟悉的词配对，但反应错误的无意义词)。随后，以长延时与短延时之差来计算记忆保持。

2.4.2 EEG数据

eeglab预处理，视觉检测伪迹，然后导入fieldtrip作进一步分析。

2.4.2.1频谱分析     

（1）计算NREM期平均功率谱（图1B），原始数据分段为15s不重叠，Hanning窗，0.5-50hz，步长0.5hz；   

（2）为了获得一整晚睡眠的连续时频图(图1C和图1D)，我们使用了multitaper谱分析。原始数据被分段为30s，85%的重叠，0.5-30hz，步长0.5hz。

2.4.2.2事件检测

基于之前建立的算法，分别对每个通道进行事件检测(图1D、2A和2C)。     

（1）慢波振荡：我们首先对连续信号进行滤波0.16-1.25Hz。然后根据时间(持续时间0.8-2秒)和振幅(75%分位数)标准选择事件。最后，我们从原始信号中提取出不含伪迹的5s分段(事件前后2.5s)。   

（2）睡眠纺锤波：我们对信号进行滤波12-16hz，然后应用希尔伯特变换提取解析振幅。我们用200ms的滑动平均数使振幅平滑。然后将振幅阈值设为75%分位数(振幅标准)，只接受超过0.5-3s阈值(时间标准)的事件。无伪迹事件被定义为峰值锁定的5s长睡眠纺锤波(峰值前后2.5s)。鉴于我们观察到年轻人和老年人之间明显的功率差异(图1B)，我们在所有后续分析之前通过z分数对每个参与者的事件进行标准化。除非另有说明（图2A）。

2.4.2.3事件锁定的谱分析

500ms Hanning窗口，计算了无伪迹标准化后的SO(图2B)的时频。谱估计在-2到2s的分段长度进行，步长50ms，频率0.5- 30hz，0.5hz步长，z分数做基线矫正（-2到-1.5s）。

2.4.2.4事件锁定的跨频率耦合

对于事件锁定跨频率分析，我们首先对标准化的SO（慢波振荡）进行滤波(0.1- 1.25 Hz)，只分析-2到2s，希尔伯特变换计算纺锤波的波幅和SO的相位。

2.4.2.5数据驱动的跨频率耦合

我们计算了非快速眼动(NREM)睡眠中15s无伪迹且不重叠的z分数后的调节指数，低频（0.5-6.5hz，0.5hz步长）和高频（8-40hz，1hz步长）。对于低频，我们使用了一个正负1hz的窗长，它是为了适应最低频率。对于高频率，窗口被调整以捕获峰值。

2.4.2.6跨频率有向分析

为了确定低频分量在睡眠纺锤波期间是否驱动睡眠纺锤波活动，我们计算了标准化信号和滤波后的信号在睡眠纺锤波范围(12-16hz)之间的跨频率的相位斜率指数（PSI）。为了避免边缘伪迹，我们将此分析限制在SO的正负2秒内，因此，这4s包括至少3个周期的SO振荡(0.75Hz)，与之前的报道一致。我们考虑了0.5-4hz之间的频率(0.5Hz步长，0.25hz带宽），应用汉宁窗提取复傅里叶系数。显著大于0表示SO驱动睡眠纺锤波活动，负值表示睡眠纺锤波驱动SO。0附近的值表示没有方向耦合。我们基于15s长的分段重复了这一分析，然后对所有可用的NREM事件进行平均，以证明所选择的窗口长度不会混淆结果（图S2D）。

2.4.2.7检测SO和纺锤波频率峰值   

（1）SO峰值频率（图1B）：用无规则重采样自动的谱分析法（IRASA）来区分真实SO振荡，我们分析了非快速眼动(NREM)睡眠期间不重叠的15s连续无伪迹数据片段，并评估了0.1到30Hz之间的频率。   

（2）除了提供平均睡眠纺锤波峰值频率的IRASA外，我们还利用线性去趋势方法来评估纺锤波频率作为SO相位的函数（图3C），我们在这里研究了SO是否在精细的时间尺度上调节睡眠纺锤波除了振幅之外的特征。因此，我们在每个通道分别对每个无伪迹SO事件(-1.25到1.25s)进行了筛选，以确定睡眠纺锤波范围内的振荡活动。

2.4.3结构像数据分析

用SPM8-VBM8做VBM分析，dartel配准，8mm高斯平滑核。PickAtlas工具包提取ROIs，海马体、丘脑、内侧前额叶皮质和眶额皮层，用于分析灰质体积与睡眠和记忆的关系。

3、结果

3.1 老年人和年轻人睡眠的振荡动力学

我们首先通过对非快速眼动睡眠中所有频率和通道的统计来评估老年人和年轻人之间的EEG功率差异（图1B，除另有说明外，由于SO和纺锤波功率的空间分布，所有数据均显示来自Cz电极的数据）。在0.5-8.5hz，10.5-15hz之间，老年人的振荡功率明显较低。

接下来，我们基于已建立的算法检测SO和睡眠纺锤波事件，纺锤波间隔分析表明，睡眠纺锤波是非泊松分布的，在非快速眼动睡眠主要是1.13- 2.78s(图S1A)，这与<1hz的SO控制睡眠纺锤波的时间并将它们至少分开1-3个周期的观点是一致的。

SO（慢波振荡）和睡眠纺锤波事件的检测可靠地跟踪了整夜睡眠中的睡眠谱信号（图1C，1D）。对于每个参与者，我们确定了检测到的睡眠纺锤波事件峰值期间的SO相位。

3.2 老化影响前额SO-纺锤波耦合

时频分析显示了睡眠纺锤波的差异（图2B，p=0.016）。具体来说，相对于年轻人，睡眠纺锤波在老年人中的峰值比SO峰值较早（图2C，图S2A）。接下来的分析发现，SO-纺锤波耦合主要在额-中央区受损（图2E），具体是0.5-2hz，12-16hz，表示年轻人的较强的耦合仅限于SO-纺锤波范围（图2F，图S2B）。

图2 年轻人和老人的SO-纺锤波交互作用

（A）左：老人（蓝色）和年轻人（红色）的波谷锁定的SO。振幅差异显著。右：在所有其他分析之前，我们对每个参与者的SO振幅进行了标准化处理，以减轻可能是由于功率和信噪比差异造成的虚假影响。（B）老人和年轻人之间SO锁定的功率差异的统计图。白色矩形线是睡眠纺锤波范围（12-16hz），黑色波形图是SO叠加平均后的。见图S2A。

（C）左：低通滤波后的老年人峰值锁定的纺锤波叠加平均（黑线）。右：年轻人的。上：SO的平均耦合相位。

（D）上：睡眠纺锤波功率达到峰值时的平均SO相位。红点表示单个被试。注意，老年人的睡眠纺锤波功率在SO正峰值之前达到峰值(0度)，而年轻人的睡眠纺锤波功率在0度左右达到峰值。下：纺锤波振幅与SO相位耦合图。再次注意，在0左右达到峰值，但老年人更早（见图S1D-S1H）。

（E）上：老年人(左)和年轻人(右)的SO-纺锤波耦合强度地形图。下：统计差异图：结果表明，额-中央区信号的耦合强度明显降低，而顶-枕叶信号的耦合强度没有差异（*表示团块矫正，双尾p小于0.05）。

（F）数据驱动的结果，黑色圈出来的地方差异显著，表示SO-纺锤波范围，见图S2B。

（G）跨频率耦合有向分析，值大于0表明SOs驱动睡眠纺锤波活动。上：我们发现额部SOs在年轻人中驱动睡眠纺锤波活动，而在老年人中不驱动(电极Fz)，而顶-枕部SO可以预测老年人和年轻人的睡眠纺锤波活动(底部；Pz；图S2C)。然而，这种效应在年轻人身上很明显。地形图(中)描述了与年轻人相比，老年人的有向SO-纺锤波的空间范围降低。请注意，此效应与选择的窗口长度无关（图S2D）。

图S2 组平均的频谱图，数据驱动分析和有向分析。

（a）SO锁定的时频图，平均的SO是黑线，黑虚线是SO最大的2个峰值。注意，老年人的睡眠纺锤波范围(12-16hz)在虚线之前达到峰值，而年轻人的睡眠纺锤波范围与虚线同时发生。

（b）总平均的相位频率图，对应图2F。注意：在老年和年轻人中，SO-纺锤波范围在年轻人中增强。（c）有向SO-纺锤波跨频率耦合。我们评估了SO是否单独预测了年轻人和老年人的纺锤波活动。因此，我们测试了每个电极的PSI。我们发现老年人有两个团块，一个是额部(p= 0.0070)，另一个是顶-枕(p= 0.0070)。重要的是，有向SO-纺锤波的影响在额-中央区减弱了。

（d）我们以检测到的SOs为中心，评估了具有类事件特征的跨频率有向耦合(CFD)。我们发现，与年轻人相比，老年人的SO-纺锤波有向跨频率耦合减少。主要差异在小于1hz范围，这一结果证实，SO驱动纺锤波活动在老年人中降低了。

3.3 皮层慢波振荡协调纺锤波活动

年轻人和老年人的SO-纺锤波耦合存在差异，根据假设和过去的SO驱动纺锤波的理论模型，接下来利用相位斜率指数(PSI)研究了SOs与睡眠纺锤波之间的方向性影响。

研究显示，SOs对睡眠纺锤波活动的方向性影响在老年人的额部和顶-枕部受到损害（图2G）。然而，尽管在老年人中顶-枕的方向CFC明显降低，但仍高于零（图S2C）。

为了检验方向性，我们测试了PSI(相位斜率指数)是否能够预测睡眠纺锤波偏离SO峰值的时间，发现，SO相位通过额叶预测纺锤波，正如SO触发纺锤波的理论模型所假设的那样，时间精度是失调的，因为方向的影响在老年人中相对于年轻人减少。

3.4 SO-纺锤波耦合预测整晚记忆巩固

在描述了SO-纺锤波耦合的振荡动力学特征并识别出老年人相对于年轻人在这些动力学中的缺陷之后，我们测试了我们的假设，即这些振荡动力学预测了一夜之间的记忆保留成功以及年龄相关的差异。     

在额叶区域发现一个显著的阳性团块，峰值在F3电极（图3A），为了进一步描述和形象化这种非线性关系，我们将平均记忆保留分数与个体平均耦合方向相结合（图3A），结果呈倒U形分布，表明当纺锤波事件发生在SO up状态峰值附近时，成功地完成了一夜之间的记忆巩固。当纺锤波出现在离up状态峰值更远的地方时，对过夜记忆保持成功的预测影响就会下降。对记忆的巩固最准确的预测是睡眠纺锤波振幅峰值在SO的up-state峰值之后出现（图3D）

图3 SO-纺锤波相互作用的时间预测记忆保持

（A）上：个体水平的平均SO-纺锤波耦合相位和整晚的记忆保留的相关性分析。F3电极效应最强。下：蓝点表示老年人；红点是年轻人。我们将与耦合阶段相关的平均行为表现置于10个重叠的bins中，以突出U形的非线性关系。

（B）耦合强度与记忆保持之间没有显著的相关性。

（C）在额(左)和顶-枕(Pz；右)电极的SO-睡眠纺锤波频率，额叶睡眠纺锤波比后脑区睡眠纺锤波慢。它们的频率只随额叶区域的SO相位的变化而变化，而老年人较低。

（D）功率分布和睡眠纺锤波频率的相关。当睡眠纺锤波刚好在SO峰之后达到峰值时，观察到最佳的表现。蓝色圆点表示老年人。深灰色条表示平均记忆表现；黑色实线描绘了一个二次拟合来近似非线性的U形关系。相反，红点、浅灰色条和黑线反映的是年轻人。

3.5 与年龄相关的灰质萎缩预示着耦合缺陷

总的来说，上述情况分析：

(1)建立振荡SO-纺锤波耦合动力学在老年人中表现出相对于年轻人的动力学缺陷。  

(2)确定SO-纺锤波耦合的时空精度可以预测过夜记忆保持成功的程度，当老年人耦合受损时，他们的遗忘会更多。

具体来说，我们测试了mPFCGM萎缩预测SO-纺锤波动态耦合程度的假设。

与假设一致，mPFC中GM体积与有向耦合呈正相关（图4A）。随着mPFC中GM体积的减小，SO-纺锤波之间的有向相位耦合减弱。虽然我们的结果证实了SOs在耦合动力学和相关记忆巩固中的关键作用，但在解剖学上，用SOs所分组的睡眠纺锤波被认为是丘脑-皮质介导的事件。鉴于这些发现，我们进行了额外的后期分析，以检查这些纺锤波相关区域的GM体积是否也预测了SO-纺锤波耦合中的损伤。

提取了所有ROIs中与睡眠相关的振荡出现的GM体积，发现了mPFC在改变SO-纺锤波耦合中的关键作用，这是一种解剖学和生理学上的关系，在其他可能的候选区域没有观察到（图4B）。

图4 有向SO-纺锤波耦合依赖于前额叶灰质体积。

（A）右上：mPFC脑区位置。左上：灰质(GM)体积与有向CFC(PSI)的相关分析的地形图显示，当参与者的GM体积越大，有向影响越强。底图：在Fz电极上具有显著相关的散点图。因此，老化的GM萎缩导致SO介导的纺锤波耦合的破坏。

（B）这种显著的关系仅限于mPFC，在其他选定区域，包括海马体、丘脑、邻近区域，如OFC和DLPFC，或任何其他控制区域(枕叶、楔前叶、后扣带和后顶叶)未观察到。

总结

皮层NREM和睡眠纺锤波之间精确的时间协调预示着海马依赖记忆的成功整合；老年人NREM振荡耦合的时间上的破坏预示着海马依赖性的整夜记忆巩固受损；老年人SOs与睡眠纺锤波时空耦合损伤的一个病理机制是mPFC灰质萎缩的严重程度。

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